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authorRichard <richard@richard-neher-mb.local>
Thu, 6 Dec 2012 06:09:42 +0000 (07:09 +0100)
committerRichard <richard@richard-neher-mb.local>
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 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
 % ARTICLE ABOUT FATE OF SYNONYMOUS MUTATIONS IN HIV
 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
-\documentclass[12pt,a4paper,notitlepage,onecolumn]{article}
+\documentclass[rmp, twocolumn]{revtex4}
 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
+%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
+
 \newcommand{\Author}{Fabio~Zanini and Richard~A.~Neher}
-\newcommand{\Title}{(Rise and fall of synonymous mutations)}
+\newcommand{\Title}{Deleterious synonymous mutations hitch-hike to high frequency in HIV \env~evolution}
 \newcommand{\Keywords}{{HIV}, {synonymous}, {population genetics}}
-%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
+
+
 \usepackage[english]{babel}
 \usepackage[utf8x]{inputenc}
 \usepackage{amsmath,amsfonts,amssymb,eucal,eurosym}
 \newcommand{\OO}{\mathcal{O}}
 \newcommand{\env}{\textit{env}}
 \newcommand{\rev}{\textit{rev}}
+\newcommand{\FIG}[1]{Fig.~\ref{fig:#1}}
+
 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
+%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
+\begin{document}
 \title{\Title}
 \author{\Author}
 \date{\today}
 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
-\begin{document}
-%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
-\maketitle
 
 \begin{abstract}
 \noindent
@@ -78,51 +82,33 @@ selective sweeps are less dense and the genetic architecture less constrained.
 %structures, termed ``insulating stems''.
 \end{abstract}
 
-\section{Introduction}
 
-HIV evolves rapidly within a single host during the course of the infection. The
-driving forces shaping this process are the high mutation rate and the strong
-selection imposed by the host immune system via killer T cells (CTLs) and
-neutralizing antibodies (AB)~\citep{pantaleo_immunopathogenesis_1996}.
+\maketitle
 
-When the host develops a CTL or AB respose against a particular viral epitope,
-rare HIV variants carrying mutated versions of the epitope, called {\it escape
-mutants}, acquire a fitness advantage and spread rapidly in the viral
-population, within a few months (see \figurename~\ref{fig:aft}, solid lines).
-During chronic infection, the (Malthusian) effect size of this beneficial
+\section{Introduction}
+
+HIV evolves rapidly within a single host during the course of the infection. This evolution is driven by strong selection imposed by the host immune system via killer T cells (CTLs) and neutralizing antibodies (AB)~\citep{pantaleo_immunopathogenesis_1996} and facilitated by the high mutation rate of HIV \citep{mansky}.
+When the host develops a CTL or AB response against a particular viral epitope, mutations that reduce or prevent recognition of the epitope frequently emerge. Escape mutations in epitopes targeted by CTLs typically evolve early in infection and spread rapidly through the population \citep{McMichael}. Later in infection, the most rapidly evolving part of the HIV genome are the so called variable loops of the envelope proteins that need to avoid recognition by neutralizing anti bodies. Mutation in \env~ spread through the population within a few months (see \figurename~\ref{fig:aft}, solid lines). During chronic infection, the (Malthusian) effect size of this beneficial
 mutations is of the order of $s_e \sim 0.01$~\citep{neher_recombination_2010}.
-The viral \env{} gene shows the fastest rates of adaptation, because is both
-rich of CTL epitopes and targeted by antibodies; its sequence diverges at rates
-of the order of $1\%$ per year~\citep{shankarappa_consistent_1999}.
-
-Many nucleotide polymorphisms that reach high frequency in the viral population
-are escape mutations: all of them are {\it nonsynonymous} (i.e. they appear in
-protein coding regions and change the amino acid sequence). Nonetheless,
-nucleotide changes unrelated to immune escape are not rare, in \env{} and
-elsewhere, and some of them become abundant alike, often rapidly. In particular,
-it is not uncommon for {\it synonymous} mutations to reach frequencies of order
-one within months from their first appearance (see \figurename~\ref{fig:aft},
-dashed lines). The biological function of these mutations within the economy of
-HIV is not well understood. By definition, the immunological phenotype, which is
-decided at the protein level, is unaffected, but other biological and ecological
-aspects of the viral lifestyle might be involved. In practice, a couple of
-RNA-level phenotypes are known. For example, within \env{} a certain RNA
-sequence, called \rev{} response element (RRE), is used by HIV to enhance
+
+These escape mutations are selected for their effect on the amino acid sequence of the viral proteins. The viral genome, however, needs to meet additional constraints such as efficient processing and translation, nuclear export, and packaging into the viral capsid which operate on the RNA level. Purifying selection beyond the protein sequence is therefore expected, while it seems reasonable that the bulk of positive selection through the immune system should be restricted to amino acid sequences. A couple important RNA elements  are well characterized. For example, within \env{} a certain RNA sequence, called \rev{} response element (RRE), is used by HIV to enhance
 nuclear export of some of its transcripts~\citep{fernandes_hiv-1_2012}. Another
 well studied case is the interaction between viral reverse transcriptase, viral
 ssRNA, and the host tRNA$^\text{Lys3}$: the latter is required for priming
 reverse transcription (RT) and bound by a specifical pseudoknotted RNA structure
 in the viral 5' untranslated region~\citep{barat_interaction_1991,
-paillart_vitro_2002}.
-
-Crucially for evolutionary purposes, the minor phenotypes caused by synonymous
-mutations might have an effect on viral fitness. For instance, recent studies
+paillart_vitro_2002}. Recent studies
 have shown that genetically engineered HIV strains with skewed codon usage bias
 (CUB) patterns towards more or less abundant tRNAs replicate better or worse,
-respectively~\citep{ngumbela_quantitative_2008, li_codon-usage-based_2012}. In
-this study, we try to characterize the fitness effects of synonymous
-polymorphisms that, at some point during chronic infection, become abundant in
-the viral population.
+respectively~\citep{ngumbela_quantitative_2008, li_codon-usage-based_2012}. 
+
+
+INFLUENZA PSEUDO VACCINE.
+
+SYNONYMOUS CONSERVATION. DO WE HAVE A PLOT OF GENOME WIDE CONSERVATION, MAYBE FOR SUPPLEMENT?
+
+Despite evidence for functional importance of specific RNA sequences, synonymous mutations are commonly used as approximate neutral markers in studies of viral evolution. Neutral markers allow to make inference about the stochastic forces driving evolution \citep{smth}. Here, we characterize the dynamics of synonymous mutations in \env{} and show that a substantial fraction of these mutations are deleterious. The central quantity we investigate is the probability of fixation of a mutation, conditional on its population frequency. Even though the synonymous mutations are deleterious and cannot be used as neutral markers, we show the degree to which they hitch-hike with nearby non-synonymous mutations is very informative. Extending the analysis of fixation probabilities to the non-synonymous mutations, we show that time dependent selection or strong competition of escape mutations inside the same epitope are necessary to explain the observed patterns of fixation and loss. 
+
 
 One simple way to assess the neutrality of synonymous mutations is to look at
 their level of conservation. Deleterious mutations at functional sites are
@@ -131,7 +117,8 @@ alleles that reach high frequencies are expected to be neutral. If genetic sites
 are independent, the equilibrium frequency of a deleterious allele with fitness
 $-s$ is $\mut / |s|$, where $\mut$ is the mutation rate per site per generation;
 neutral alleles have no equilibrium frequency and can slowly fix via genetic
-drift~\citep{ewens_mathematical_2004}. If the focal synonymous mutant is linked
+drift~\citep{ewens_mathematical_2004}.
+t If the focal synonymous mutant is linked
 to another nonneutral allele, however, its frequency is the result of the
 combined fitness effects of both sites, and simple conservation-level analyses
 fail. Since recombination in HIV is known to happen
@@ -140,46 +127,44 @@ context of the synonymous change at hand must be taken into account. Our
 results underline the importance of the latter scenario for intrapatient HIV
 evolution.
 
+
+
+
 \section{Results}
-We analyze from time series of viral nucleotide sequences from single patients,
-which span several years of chronic
-infection~\citep{shankarappa_consistent_1999, bunnik_autologous_2008,
-liu_selection_2006}. Plotting the allele frequencies against time for all
-polymorphic sites, it is evident that, although nonsynonymous changes are
-widespread, synonymous ones are also present in various occasions at high
-frequency (see \figurename~\ref{fig:aft}).
+A neutral mutation segregating at frequency $\nu$ has a probability $\nu$ to spread through the population and fix, while it is lost with probability $1-\nu$. This is a simple consequence of the fact that exactly one of present $N$ individuals will be the common ancestor of the entire population at a particular locus and this ancestor has a probability $\nu$ of carrying this mutations, see illustration in \FIG{illustration}. Deleterious or beneficial mutations, in contrast, should fix less or more often, respectively. Time series sequence data therefore suggest a simple way to investigate average properties of different classes of mutations. 
+
+\paragraph{Synonymous mutations in \env, C2-V5 are mostly deleterious}
+
+\FIG{aft} shows time series data of the frequencies of all mutations observed \env, C2-V5, in patient ??\citep{shankarappa_consistent_1999,liu_selection_2006}. Despite many synonymous mutations reaching high frequency, very few fix. This observation in further quantified in panels ? and ?, that stratify the data of ?? patients (see methods) according to the frequency at which different mutations are observed. Considering all mutations in a frequency interval $\nu_0$ at some time $t_i$, we calculate the fraction that is found at frequency 1, frequency 0, or at intermediate frequency at later time points $t_f$. Plotting these fixed, lost, and polymorphic fraction against the time interval $t_f-t_i$, we see that most synonymous mutations segregate for roughly one year and are lost  much more frequently than expected. The ultimate probability of loss or fixation is shown as a function of the initial frequency $\nu_0$ in panel ??. In contrast to synonymous mutations, the non-synonymous seem to follow more a less the neutral expectation -- a point to which we will come back below. 
+
+
 \begin{figure}
 \begin{center}
 \includegraphics[width=\linewidth]{Shankarappa_allele_freqs_trajectories_syn_nonsynp8}
-\caption{Allele frequency trajectories of typical patient, C3-V5, nonsynonymous
-(solid) and synonymous mutations (dashed lines). Most synonymous mutations are
-not fixed. Colors are set according to the position of the site along the C3-V5
-region (red to blue). Data from Ref.~\cite{shankarappa_consistent_1999}.}
+\includegraphics[width=\linewidth]{Shankarappa_fix_loss_dt_times}
+\caption{Synonymous mutations rarely fix in \env, C2-V5: Panel A shows mutation 
+frequency trajectories observed in patient ?? \cite{shankarappa_consistent_1999};  Nonsynonymous
+and synonymous mutations are shown as solid and dashed lines, respectively. 
+Colors indicate the position of the site along the C2-V5 region (red to blue) ADD COLORBAR. MAYBE MAKE FIGURE WITH SYNONYMOUS AND NONSYN SEPARATELY.
+While non-synonymous mutations frequently fix, very few synonymous mutations do even though they are frequently observed at intermediate frequencies. Panel B quantifies time course of loss and fixation of synonymous mutations observed in a frequency interval $\nu_0$. The ultimate fraction of synonymous mutations that fix as a function of intermediate frequency $\nu_0$.
+}
 \label{fig:aft}
 \end{center}
 \end{figure}
-Moreover, many mutations appear to change rapidly in frequency as a flock,
-especially at the lower end of the frequency spectrum. These observations lead
-to the idea that linkage might be widespread at the time scale of the typical
-selective sweep, i.e. a few months~\citep{neher_recombination_2010}. It seems
-therefore likely that synonymous mutations are not attaining high frequencies by
-genetic drift but are rather exponentially amplified by selection on linked
-nonsynonymous sites, a process known as {\it genetic
-draft}~\citep{neher_genetic_2011}.
-
-To test this hypothesis, we focus on the long-time fate of such synonymous
-derived alleles {\it after} they are already abundant. According to the neutral
-theory of independent sites, (a) an allele starting at frequency $\nu$ will
-reach fixation, in the long-time limit, with a probability $P_f(\nu) = \nu$, and
-get extinct otherwise; (b) the time required to reach either boundary, fixation
-or extinction, is essentialy the inverse of the population size (in
-generations), hence much longer than five years for HIV~\citep{boltz_ultrasensitive_2012}.
+
+\citet{bunnik_autologous_2008} present a longitudinal data sets on the entire \env~gene of ?? patients at ?? time points with ??-?? sequences each. Repeating the above analysis separately on the C2-V5 region studied above and the remainder of \env~ reveal strikingly different behavior inside and outside the hyper variable region. Within C2-V5, this data fully confirms the observations made in the data set by \citet{shankarappa_consistent_1999}. In the remainder of \env, however, observed synonymous mutations behave as if they were neutral; see \FIG{fixp}. 
+
+ARE OBSERVED SYNONYMOUS MUTATIONS OUTSIDE C2-V5 NEUTRAL? DOES LOSS/FIX CORRELATE WITH CONSERVATION. CAN WE LOOK AT THE AVERAGE LEVEL OF CONSERVATION STRATIFIED BY MAX FREQ? MAYBE WE COULD HAVE ONE -- COMPLETELY CIRCULAR -- FIGURE SHOWING LOSS/FIX VS CONSERVATION.
+
+These observations suggest that many of the synonymous mutations in the part of \env~that includes the hyper variable regions are deleterious, while outside this regions only roughly neutral mutations are polymorphic.
+
+
+
 \begin{figure}
 \begin{center}
 \subfloat{\includegraphics[width=0.49\linewidth]{Bunnik2008_fixmid_syn_ShankanonShanka}}
-\subfloat{\includegraphics[width=0.49\linewidth]{Shankarappa_fixmid_syn_V_regions}}
 \caption{Left panel: fixation probability of derived synonymous alleles is strongly
-suppressed in C3-V5 versus other parts of the {\it env} gene, and of
+suppressed in C2-V5 versus other parts of the {\it env} gene, and of
 nonsynonymous ones.
 Right panel: especially hard is fixation of new alleles in conserved regions flanking the V
 loops. The black dashed line is the prediction from neutral
@@ -189,84 +174,13 @@ Refs.~\cite{shankarappa_consistent_1999, bunnik_autologous_2008}.}
 \end{center}
 \end{figure}
 
-The left panel of \figurename~\ref{fig:fixp} shows the fixation probability of
-derived alleles seen within various frequency windows. With regard to synonymous
-alleles, the average over the whole HIV genome (organce line) matches closely
-the expected result from neutral theory (dashed line). A different picture
-emerges when the most variable part of the genome, V1-C5 region of \env{},
-is zoomed into (red line). Two independent datasets, from
-refs.~\citep{shankarappa_consistent_1999, bunnik_autologous_2008} yield the same
-result, i.e. that synonymous mutations hardly fix at all.
-
-A related observation can be made on the nonsynonymous alleles (blue line).
-Although we see no difference between different parts of the HIV genome, the
-neutral-like shape of $P_f$ is at odds with the na\"ive expectation that most
-nonsynonymous alleles reaching high frequency are to-be-fixed escape mutations.
-
-Moreover, as illustrated in \figurename~\ref{fig:fixtimes}, the time for
-synonymous alleles to reach the first boundary starting from intermediate
-frequencies is of the order of 500 days which, assuming a conservative
-generation time of one day~\citep{perelson_hiv-1_1996}, correspond to the same
-number of generations. This time would only be possible in a neutral scenario
-if the population size of HIV were extremely small, of the order of $10^3$, much
-smaller then both theory and experiments
-indicate~\citep{boltz_ultrasensitive_2012}.
-% WE SHOULD REALLY CITE OURSELVES IN THE (HOPEFUL) FUTURE HERE :-)
-\begin{figure}
-\begin{center}
-\includegraphics[width=\linewidth]{Shankarappa_fix_loss_dt_times}
-\caption{Fixation or extinction times for synonymous alleles starting from
-intermediate frequencies. The colored bands are the final fixation
-probabilities expected from neutral theory; the observed alleles are fixed
-less frequently than expected. The timescale of fixation/extinction is
-approximately 500 days, corresponding to a selective effect of $\sim -0.001$.}
-\label{fig:fixtimes}
-\end{center}
-\end{figure}
 
-Taken together, these findings suggest that synonymous (and some nonsynonymous)
-alleles are not propagating independently by genetic drift, but rather
-hitchhiking on neighbouring beneficial alleles. This conclusion is also
-consistent with the currently accepted estimate for the outcrossing rate of HIV,
-of the order of $1\%$ per generation. Although synonymous alleles can be drafted
-to high frequency by linkage and selection, they decouple on a time scale of the
-order of 100 days, which is also the average time it takes a (nonsynonymous)
-selected allele to spread through the population during chronic
-infection~\citep{neher_recombination_2010}.
-
-\figurename~\ref{fig:fixp} (left panel) also suggests that at least some
-synonymous mutations in the V1-C5 region should be deleterious. We analyze this
-hypothesis in two ways. First of all, we look for possible biological causes for
-such a behaviour. Furthermore, we perform computer simulations of viral
-evolution under a wide range of parameters in order to reproduce the results for
-the fixation probability and study the regions of the parameter space compatible
-with the observations.
-
-One possible {\it a priori} explanation for deleterious fitness effects of
-synonymous mutations is the presence of secondary structures in the viral RNA.
-If any RNA secondary structures are functionally relevant for HIV replication,
-mutations in nucleotides involved in those base pairs are expected to revert
-more easily than by pure chance, to keep those structures in place. The
-propensity of nucleotides to form base pairs in HIV has been measured
-recently\citep{watts_architecture_2009}, and the HIV genome has resulted to be
-highly structured~\citep{forsdyke_reciprocal_1995, watts_architecture_2009}.
-Watts {\it et al.} have measured the propensity of any nucleoside to be attacked by
-external chemicals (SHAPE reactivity) and shown that a higher reactivity
-corresponds to a smaller likelihood of being involved in an RNA helix. As far as
-the V1-C5 region is concerned, it has been shown that the short C1-5 regions
-have a high tendency to form {\it insulating
-stems}~\citep{watts_architecture_2009, sanjuan_interplay_2011}. Since the V1-5
-loops have to be highly variable to ensure immune escape, their destabilizing
-contribution to the viral RNA structure is though to be buffered by the
-surrounding, base-pair rich stems. To test whether or not insulating stems might
-be the reason for the reduced fixation probability, we partition the data
-depending on their position in the V1-C5 region. Consistently with the
-expectations, $P_f$ is more heavily readuced in the stems than in
-the loops (see \figurename~\ref{fig:fixp}, right panel).
-
-Despite this indirect result supporting the involvement of RNA secondary
-structure in the deleterious effects of synonymous mutations in V1-C5, we set
-out to seek more direct evidence. We partition all synonymous alleles observed
+\paragraph{Synonymous mutations in C2-V5 tend to disrupt conserved RNA stems}
+One possible {\it a priori} explanation for lack of fixation of synonymous mutations in C2-V5 are  secondary structures in the viral RNA. If any RNA secondary structures are relevant for HIV replication,
+mutations in nucleotides involved in those base pairs are expected  to be deleterious and to revert preferentially. 
+Many functionally important secondary structure elements have been characterized, including  the  \rev{} response element (RRE) to enhance nuclear export of some of its transcripts~\citep{fernandes_hiv-1_2012}. Another well studied case is the interaction between viral reverse transcriptase, viral ssRNA, and the host tRNA$^\text{Lys3}$: the latter is required for priming reverse transcription (RT) and bound by a specifical pseudoknotted RNA structure in the viral 5' untranslated region~\citep{barat_interaction_1991, paillart_vitro_2002}. It has been suggested early on that parts of the viral genome that has the potential to form stems as better conserved that the remainder \citep{forsdyke_reciprocal_1995}.
+
+Recently, the propensity of nucleotides of the HIV genome to form base pairs has been measured using the SHAPE assay (a biochemical reaction preferentially altering unpaired bases) \citep{watts_architecture_2009}. The SHAPE assay has shown that the variable regions V1 to V5 tend to be unpaired, while the conserved regions between those variable regions form stems. We partition all synonymous alleles observed
 at intermediate frequencies above 10-15\% depending on their final destiny
 (fixation or extinction). Subsequently, we align our sequences to the reference
 NL4-3 strain used in ref.~\citep{watts_architecture_2009} and assign them SHAPE
@@ -274,36 +188,7 @@ reactivities. As shown in \figurename~\ref{fig:SHAPE} (left panel) in a
 cumulative histogram, the reactivity of fixed alleles are systematically larger
 than of alleles that are doomed to extinction. In other words, alleles that are
 likely to be breaking RNA helices are also more likely to revert and finally be
-lost from the population.
-\begin{figure}
-\begin{center}
-\subfloat{\includegraphics[width=0.49\linewidth]{mixed_Shankarappa_Bunnik2008_Liu_fixation_reactivity_Vandflanking_fromSHAPE}}
-\subfloat{\includegraphics[width=0.49\linewidth]{mixed_Shankarappa_Bunnik2008_Liu_fixation_reactivity_nonVandflanking}}
-\caption{Watts et al. have measured the reactivity of HIV nucleotides to {\it
-in vitro} chemical attack and shown that some nucleotides are more likely to
-be involved in RNA secondary folds. C1-C5 regions, in particular, show
-conserved stem-loop structures~\citep{watts_architecture_2009}. We show that
-among all derived alleles in those regions reaching frequencies of order one,
-there is a negative correlation between fixation and involvement in a base
-pairing in a RNA stem (left panel). The rest of the genome does not show any
-correlation (right panel). There might be too few silent polymorphisms in the
-first place, or the signal might be masked by non-functional RNA
-structures. Data from Refs.~\cite{shankarappa_consistent_1999,
-bunnik_autologous_2008, liu_selection_2006}.}
-\label{fig:SHAPE}
-\end{center}
-\end{figure}
-
-Since the insulating stems are not the only RNA secondary structures found by
-the authors of ref.~\citep{watts_architecture_2009}, we repeated the same
-partitioning based on fate on the rest of the HIV genome. As shown in the right
-panel of \figurename~\ref{fig:SHAPE}, there is no evidence that a similar
-mechanism is acting outside of the V1-C5 region. This is not fully surprising,
-because it is well known that single stranded RNA chains tend to form a lot of
-spontaneous structures, most of which have no biological function. Furthermore,
-the averaging over many different genomic regions might worsen the
-signal-to-noise ratio, which is already quite low, and result in
-indistinguishable histograms.
+lost from the population. We then split the synonymous mutations in the C2-V5 region further into conserved and variable regions and found that the biggest depression in fixation probability is observed in the conserved stems, while the variable loops show little deviations from the neutral signature; see \FIG{SHAPE}B. 
 
 In addition to RNA secondary structure, we have considered other possible
 explanations for a fitness effect of synonymous mutations, in particular codon
@@ -328,55 +213,46 @@ fixation probability is only observed there. In conclusion, although we cannot
 exclude an effect of CUB on fitness as a general rule, we expect it to be a
 minor effect in our context.
 
-We also perform computer simulations of evolving viral population under
-selection and rare recombination. For this purpose, we use the recently
-published package FFPopSim, which includes a module dedicated to intrapatient
-HIV evolution~\citep{zanini_ffpopsim:_2012}. We analyze many combination of
-parameters such as population size, recombination rate, selection coefficient
-and density of escape mutations, epitope length, deleterious effect of
-synonymous mutations. The purpose of the simulations is to probe the population
-genetics mechanisms required to reproduce the fixation probabilities of
-\figurename~\ref{fig:fixp}, simultaneously for synonymous and nonsynonymous
-alleles.
-
-The main result of the simulations is that genetic draft can indeed generate a
-depression in fixation probabilities, but only under relatively tight
-circumstances. In terms of model confidence, this is a good result: the
-probability of obtaining the experimental curves by pure chance is negligible.
-\figurename~\ref{fig:simfixp} shows two instances of successful simulations.
 \begin{figure}
 \begin{center}
-\subfloat{\includegraphics[width=0.49\linewidth]{fixation_probability_shortgenome_N_1e4_epitopes_example_longer}}
-\subfloat{\includegraphics[width=0.49\linewidth]{fixation_probability_N_1e4_3ingredients_3rddel_envnonenv_stopall}}
-\caption{Simulations show that the suppression of fixation probability can be
-generated by linkage to sweeping nonsynonymous alleles nearby. Two possible
-scenarios are competition between escape mutants (left panel) and time-dependent
-selection due to immune sytem recognition (right panel).}
-\label{fig:simfixp}
+\subfloat{\includegraphics[width=0.49\linewidth]{mixed_Shankarappa_Bunnik2008_Liu_fixation_reactivity_Vandflanking_fromSHAPE}}
+\subfloat{\includegraphics[width=0.49\linewidth]{Shankarappa_fixmid_syn_V_regions.pdf}}
+\caption{Watts et al. have measured the reactivity of HIV nucleotides to {\it
+in vitro} chemical attack and shown that some nucleotides are more likely to
+be involved in RNA secondary folds. C1-C5 regions, in particular, show
+conserved stem-loop structures~\citep{watts_architecture_2009}. We show that
+among all derived alleles in those regions reaching frequencies of order one,
+there is a negative correlation between fixation and involvement in a base
+pairing in a RNA stem (left panel). The rest of the genome does not show any
+correlation (right panel). There might be too few silent polymorphisms in the
+first place, or the signal might be masked by non-functional RNA
+structures. Data from Refs.~\cite{shankarappa_consistent_1999,
+bunnik_autologous_2008, liu_selection_2006}.}
+\label{fig:SHAPE}
 \end{center}
 \end{figure}
 
-First of all, in order for $P_f$ to be reduced to levels seen in the data, most
-synonymous mutants habe to be slightly deleterious. The reason is that if
-synonymous alleles are an even mixture of deleterious and neutral ones, the
-latter are much more likely to be carried to high frequencies by genetic draft,
-because they present no burden to escape mutations. The synonymous $P_f$ is then
-dominated by these neutral alleles and the depression induced by the few
-deleterious ones becomes undetectable.
 
-Furthermore, the two crucial parameters that control the fixation probability
+\paragraph{Deleterious mutations are brought to high frequency by hitch-hiking}
+While the observation that some fraction of synonymous mutations is deleterious is not unexpected, it seems odd that we observe them at high population frequency -- at least in some regions of the genome. The region of \env~in which we observe deleterious mutations at high frequency is special in that it undergoes frequent adaptive changes to evade recognition by neutralizing antibodies \cite{Williamson}. Due to the limited amount of recombination in HIV \cite{neher_recombination_2010,batorsky_2011}, deleterious mutations that are linked to adaptive variants can reach high frequency \citep{maynard_smith}.
+
+The potential for hitch-hiking is already apparent from the allele frequency trajectories in \FIG{aft}, where many mutations appear to change rapidly in frequency as a flock. Deleterious synonymous mutations can be amplified exponentially by selection on linked nonsynonymous sites, a process known as {\it genetic draft}~\citep{neher_genetic_2011}. In order to be advected to high frequency by a linked adaptive mutation, the deleterious effect of the mutation has to be substantially smaller than the adaptive effect. The latter was estimated to be on the order of $s_a = 0.01$ per day. The approximate magnitude of the deleterious effects can be estimated from \FIG{fixtimes}, that shows the distribution of times for synonymous alleles to reach the fix or get lost starting from intermediate frequencies. The typical time to loss is of the order of 500 days. If this loss is driven by the deleterious effect of the mutation, this corresponds to deleterious effects of roughly $0.002$ per day.
+
+To get a better idea of the range of parameters that are compatible with the observations and our interpretation, we  perform computer simulations of evolving viral populations under selection and rare recombination. For this purpose, we use the recently published package FFPopSim, which includes a module dedicated to intra-patient
+HIV evolution~\citep{zanini_ffpopsim:_2012}. We analyze many combinations of
+parameters such as population size, recombination rate, selection coefficient
+and density of escape mutations, deleterious effect of synonymous mutation.
+
+The main result of the simulations is that genetic draft can indeed bring weakly deleterious mutations to high frequencies and result in a dependence of the fixation probability on initial frequency that is compatible with observations. We quantify the reduction in fixation probability by the area under the diagonal.... Since neutral mutations are much more likely to rise to high frequency than deleterious ones, the majority of the synonymous mutations needs to be slightly deleterious observe a significant reduction of $p_{fix}$. Furthermore, the two crucial parameters that control the fixation probability
 are the following: (a) the deleterious effects of hitchhikers compared to
 the beneficial effects of escape mutants, and (b) the density of escape
 mutations. Intuitively, a higher density of escape mutations (i.e., epitopes)
 enables a larger degree of genetic draft, because escape mutations start to
 combine and their effects add up. In \figurename~\ref{fig:simheat} (left panel),
-we show that this is indeed the case in simulations. For any combination of
-parameters, we get a curve like those shown in \figurename~\ref{fig:simfixp} and
-we measure the area between the curve and the diagonal (neutral prediction). An
-area around 0.20 to 0.35 correspond to a concave curve; an area of 0.45 means no
-genetic draft at all; an area of 0 means a neutral-like fixation probability.
-The data-like parameter region that produces concave $P_f$ curves is roughly
-marked by the ellipse and confirms the aforementioned intuitive expectation.
+we show that this is indeed the case in simulations.
+
+SHOW THAT THE DEPRESSION WORKS.
+
 \begin{figure}
 \begin{center}
 \subfloat{\includegraphics[width=0.49\linewidth]{fixation_loss_shortgenome_area_ada_frac_del_eff_coi_0_01_nescepi_6_heat.pdf}}
@@ -394,94 +270,23 @@ within a few months of antibody production.}
 \end{center}
 \end{figure}
 
-Third, the effects of more dense escape mutations also affects the fixation
-probability of {\it nonsynonymous} alleles. In real data, among all
-nonsynonymous changes, there is no way to distinguish {\it a priori} between
-escape mutations and hitchhikers. The fixation probability of nonsynonymous
-derived alleles is an average over both, weighted by their abundances at the
-starting frequency. In case of denser epitopes, this average is enriched in
-escape mutations, most of which are destined to fix as soon as they reach their
-establishment frequency $(sN)^{-1} \ll 0.1$~\citep{desai_beneficial_2007}. The
-measured $P_f$ for nonsynonymous alleles in HIV is, however, in hardly any
-excess above the neutral line (see \figurename~\ref{fig:fixp}, blue line). In
-order to reconcile simulations with data on this point, several requirements
-have to be met. First of all, the density of epitopes has to be fairly small,
-lest they dominate the average and cause a strong rise in $P_f$. The parameter
-region compatible with the data is indicated in the right panel of
-\figurename~\ref{fig:simheat} with a circle in the top-left corner,
-corresponding to deleterious effects of synonymous changes of roughly $-0.001$.
-
-Moreover, even at the smallest epitope densities for which genetic draft is
-still effective, it is still much more likely for an escape mutation to both
-reach a high frequency and subsequently fix, compared to a nonsynonymous
-hitchhiker. In HIV, however, as shown in \figurename~\ref{fig:fixtimes}, it is
-quite common for a nonsynonymous mutation (solid lines) to reach majority quicky
-and yet eventually get extinct. This conundrum is suggestive of an active
-mechanism, in real HIV infections, for decreasing the fitness of escape mutants
-over time. We test two possible such mechamisms that are biologically plausible
-and find some evidence in the clinical literature: time-dependent selection and
-within-epitope competition. The former concept refers to the possibility that
-the host immune system slowly recognizes the escape mutants and, by deploying
-its countermeasures (antibodies and killer T cells), reduces its fitness during
-a selective sweep, dooming it to extinction despite the initial quick rise in
+
+However, if hitch-hiking is driven by non-synonymous mutations that are unconditionally beneficial, we should find that non-synonymous mutations almost always fix once they reach high frequencies -- in contrast with \FIG{fixp} that shows that non-synonymous mutations fix as if they were neutral. We know, however, that non-synonymous variation in the variable regions is driven by positive selection. Inspecting the trajectories of non-synonymous mutations suggest the rapid rise and fall of many alleles.  We test two possible such mechanisms that are biologically plausible
+and could explain the transient rise of non-synonymous mutations: time-dependent selection and
+within-epitope competition. If the immune system starts recognizes the escape mutant before its fixation, the mutant might cease to be beneficial and disappears despite its quick initial rise in
 frequency. An example for the fixation probabilities generated by this kind of
-models is shown in \figurename~\ref{fig:simfixp} (right panel). This scenario
-finds some backing in the clinical literature: an antibody response to escape
-mutants is indeed present; the delay of this response compared to appearance of
-the escape mutation, a few months, matches the average sweep time of an escape
-mutant. It is therefore not unlikely that the immune system catch the mutant
-during the sweep and neutralize it before fixation~\citep{richman_rapid_2003,
-bunnik_autologous_2008}. The alternative scenario, however, namely
-within-epitope competition, is also valid. The basic idea is that, since the
-mutation rate of HIV is high, several different escape mutations can be seeded
-at the same time and start to spread. Their fitness benefits are not additive,
-because each of them is essentially sufficient to warrant invisibility to the
-host immune system (e.g. to suppress antibody binding). As a consequence, the
-fastest allele to establish is most likely to reach fixation; later escape
-mutants can still reach frequencies of order one because they initially only
-replace wild type viruses; they are eventually swept away by the more abundant,
-early established mutant. This kind of epistatic interactions within epitopes is
-proven able to reduce fixation probabilities in simulations
-(\figurename~\ref{fig:simfixp}, left panel). Furthermore, the emergence of
-multiple sweeping nonsynonymous mutations in real HIV infections has been shown
+models is shown in \figurename~\ref{fig:simfixp} (right panel). In support of this idea, \citet{richman_rapid_2003,
+bunnik_autologous_2008} report antibody responses to escape mutants. These respones are delayed by a few months, roughly matching the average sweep time of an escape mutant. Alternatively, several different escape mutations in the same epitope can arise almost simultaneously and start to spread. Their fitness benefits are not additive, because each of them is essentially sufficient to escape. As a consequence, several mutations rise to high frequency, while the escape with the smallest cost is most likely to eventually fix. In simulations, this kind of epistatic interactions within epitopes is reduces fixation probabilities in simulations (\figurename~\ref{fig:simfixp}, left panel). The emergence of multiple sweeping nonsynonymous mutations in real HIV infections has been shown
 previously~\citep{moore_limited_2009}.
 
 \section{Discussion}
-In the HIV research community, synonymous changes have been known for a long
-time to have potential fitness effects, for instance via the RRE element or the
-priming of RT via tRNA$^\text{Lys3}$~\citep{fernandes_hiv-1_2012,
-paillart_vitro_2002}. Despite the large {\it corpus} of biochemical studies on
-these phenomena, the evolutionary significance of nonneutral synonymous changes
-reimains to be assessed. In this study, we show that, in the epitope-rich V1-C5
-\env{} region, synonymous changes with deleterious effects are actively lost
-during the course of the infection. Note that, although most of these alleles
-are indeed rare at the population level, i.e. across HIV-infected subjects, that
-fact alone is not sufficient to infer fitness effects, because of the
-confounding effect of phylogeny. Conversely, the positive correlation between
-intrapatient extinction and interpatient rarity implies, on the light of our
-findings, that these alleles should be constantly depleted from the pool of
-circulating HIV strains by natural selection. A mechanistic insight into this
-process is not trivial, however, because the time scale of the intrapatient
-depletion is long, $s^{-1} \sim 10^3~\text{days}$, whereas transmission is
-thought to happen mostly during early infection~\citep{brenner_high_2007}.
-
-With respect to the correlation with RNA seconary structure, functional
-significance of the insulating stems has been proposed
-previously~\citep{watts_architecture_2009, sanjuan_interplay_2011}, but its
-direct microevolutionary consequences are less clear. Our analysis is akin to
-that in ref.~\citep{sanjuan_interplay_2011} in terms of overall goals, but
-provides direct evidence that insulating stems are relevant for viral fitness
-{\it in vivo}. In absence of clear-cut biochemical experiments, our results
-confirm the hypothesis that insulating stems might be needed to organize the
-viral RNA during packaging in such a way as to avoid unwanted structures caused
-by mutations in the hypervariable loops. In addition, although the fitness
-effects involved are quite small (ten times smaller than the typical benefit of
-an escape mutation), the consistency across unrelated patients makes these stems
-an attractive potential target for therapeutic drugs. Unfortunately, our
-approach yields a rather weak, if locally highly significant, signal. Whether or
-not similar RNA secondary structures are present in other regions of the genome
-remains largely an unanswered question, although we do not find evidence in this
-sense. 
+Despite several known functional roles for RNA secondary structure in the HIV genome, synonymous mutations are often used as approximately neutral markers in evolutionary studies of viruses. We have shown that the majority of synonymous mutations in the conserved regions C2-C5 of the \env~gene are deleterious. Comparison with recent biochemical studies of binding propensity of bases in RNA genome suggest that these mutations are deleterious in part because they disrupt stems in RNA secondary structure. Furthermore, we provide evidence that these mutations are brought to high frequency through linkage to adaptive mutations. The latter  mutations are only transiently adaptive, either through a coevolution with the immune system or redundant escape within an epitope. 
+
+Our observations and conclusion rely heavily on longitudinal data in which the dynamics of mutations can be explicitly observed. The fact that deleterious mutations can be brought to high frequencies through hitch-hiking underscores the vigorousness of the coevolution with the immune system. The fact that multiple escape mutations in the same epitope -- as is indeed observed in studies of antibody escape \citep{sdfsd} -- are necessary to explain the patterns of fixation of non-synonymous mutations points towards a large populations size that rapidly discovers adaptive mutations. A similar point has been made recently by \citet{boltz_ultrasensitive_2012} in the context of preexisting drug resistance mutations. 
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+The observed hitch-hiking highlights the importance of linkage due to infrequent recombination for the evolution of HIV \citep{neher_recombination_2010,batorsky_estimate_2011,joseffson_smth_2011}. The recombination rate has been estimated to be on the order of $\rho = 10^{-5}$ per base and day. It takes roughly $t_{sw} = s^{-1} \log \nu_0$ generations for an adaptive mutation with growth rate $s$ to rise from an initially low frequency $\nu_0\sim \mu$ to frequency one. This implies that a region of length $l = (\rho t_{sw})^{-1} = s/(\rho \log \nu_0)$ remains linked to the adaptive mutation. With $s=0.01$, $l\approx 100$ bases which is consistent with strong linkage between the variable loops and the stems in between. Furthermore, we do not expect much hitch-hiking to extend far beyond the variable regions consistent with the lack of signal out side of C5-V5. In case of much stronger selection -- such as observed during early CTL escape or drug resistance evolution -- the linked  region is of course a lot larger. 
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+The functional significance of the insulating RNA structure stems between the hyper variable loops has been proposed previously~\citep{watts_architecture_2009, sanjuan_interplay_2011}. Our analysis is akin to that in ref.~\citep{sanjuan_interplay_2011} in terms of overall goals, but provides direct evidence that insulating stems are relevant for viral fitness {\it in vivo}. Our analysis is limited by the availability of longitudinal data which requires a focus on the the variable regions of \env. Conserved RNA structures likely exist (and several are known) in different parts of the HIV genome. In absence of repeated adaptive substitutions in the vicinity that cause hitch-hiking, the deleterious synonymous mutations will remain at low frequencies and can only be observed by deep sequencing methods. 
 
 As far as population genetics models are concerned, our study uncovers the
 subtle balance of evolutionary forces governing intrapatient HIV evolution. The